A muslica (Drosophila melanogaster) embrionális központi idegrendszerének használata a nyúlványnövekedés vizsgálatához

A muslicát, mint modellorganizmust előszeretettel használják az idegrendszer fejlődésének vizsgálatára, ezen belül is az egyik általánosan használt idegszövet az embrionális központi idegrendszer.

A muslicák embrionális idegrendszere a neuroektodermából alakul ki, olyan ektodermális sejtekből, melyeknek megvan a képességük arra, hogy idegsejteket és epidermiszt alakítsanak ki. A ventrális neurogén régió hozza létre a hasi idegköteg neuroblasztjait, mely a központi idegrendszer részeként a szegmentált csírasávhoz tartozik. Az agyi struktúra kialakításáért a feji neurogén régió a felelős. Az ektoderma neurogén régiója nemcsak neuroblasztokat, hanem epidermális prekurzorokat is tartalmaz, melyek a későbbiekben a ventrális epidermiszt, és a fej epidermiszét alakítják ki. A hasi neurogén régió tekintetében a delaminációban hemiszegmentenként 30 sejt vesz részt (neuroblasztok), a többi sejt a hasi epidermiszt alakítja ki. A neuroblasztok őssejtként osztódva kb. öt osztódási cikluson mennek keresztül, létrehozva a gaglion anyasejteket. Minden ganglion anyasejt keresztülmegy egy ekvális osztódáson, melynek eredményeképpen 2 neuron jön létre, kialakítva ezzel a hemiszegmentenkénti kb. 200 embrionális neuront (1. ábra).

1. ábra Neurogenezis a Drosophila embrióban. A neuroektoderma sejtek (NE, sárga) delaminációjával létrejönnek a neuroblasztok (NB, zöld). Minden NB őssejt módjára osztódva ganglion anyasejteket (GMC/ganglion mother cells/, narancssárga) hoz létre, melyek osztódásával jönnek létre az idegsejtek (n, piros).

Az idegsejtek terminális differenciálódása az embriogenezis 13. stádiumában kezdődik. Neuronok egy csoportjában kialakulnak az első nyúványok a központi idegrendszer felszínén. Később ezen pionír pályák mentén fognak futni a később differenciálódó neuronok axonjai. Ezek a nyúlványok rendkívül jellegzetes, létra alakú kötegekbe rendeződnek, melyek a szegmenteket összekötő hosszanti kötegekből, ill. az embrionális idegrendszer két oldalán kialakuló hosszanti kötegeket összekötő keresztkötegekből (komisszúrákból) állnak (2.ábra). A keresztkötegek száma szegmentenként kettő, és mind a keresztkötegek, mind a hosszanti kötegek tartalmazzák interneuronok és motoneuronok nyúványait is. A központi idegrendszer területéről kilépő motoneuron axonok minden szegmenten belül egy elülső (interszegmentális ideg) és egy hátulsó pálya (szegmentális ideg) mentén hagyják el a hasi idegkötegeket. A perifériáról a központba tartó érzőidegek szintén az imént említett pályák mentén haladnak.

Az embriogenezis utolsó stádiumai során a hasi idegkötegek megrövidülnek és kondenzálódnak, így az embrionális fejlődés végén a központi idegrendszer egy agyi és egy az embrió teljes hosszát végig nem érő hasi idegkötegre különül (2. ábra) (összefoglalva: Campos-Ortega J.A. és Hartenstein, 1997; Goodman,C.S. és Doe,C.Q., 1993).

2. ábra 17.stádiumú Drosophila embrió központi idegrendszerének sematikus képe

Az nyúlványnövekedésben szerepet játszó gének vizsgálatára a hasi idegköteg igen alkalmas. A hosszanti és keresztkötegek által kialakított „létraszerű” nyúlványmintázat egy általános nyúlvány-specifikus ellenanyag, a BP102 (DSHB) használatával könnyen láthatóvá tehető (3. ábra). A mutáns állatok vizsgálata során megfigyelhető mintázatbeli változás (szakadás, hiány, vastagodás) alapján következtethetünk az adott gén nyúlványnövekedés során betöltött funkciójára.

3. ábra Az általános nyúlvány-specifikus marker (BP102) mintázata az embrionális központi idegrendszer területén

A mutánsok vizsgálatához meghatározott korú (16. -17. stádiumú) embriókat használunk, melyek hasi idegkötege már megrövidült, így jól láthatóvá válnak az esetleges nyúlványmintázatot érintő elváltozások. A vizsgálatok során általánosan használt a csapadékos (3,3'-Diaminobenzidine (DAB) felhasználásával történő) előhívás, mely a mutáns analízis során nem teszi szükségessé a fluoreszcens mikroszkóp használatát (4. ábra). 

4. ábra Vad típusú (A) és mutáns embriók (B-D) központi idegrendszerének nyúlványmintázata BP102 ellenanyag használatával, csapadékos (DAB) előhívás mellett

Ahhoz azonban, hogy ezekről a hasi idegkötegekről jó minőségű felvételt tudjunk készíteni, ajánlott az idegi szövet kiboncolása, melyről a következő linken elérhető egy rövid bemutató videó: 

https://www.youtube.com/watch?v=rDeJVs2THjI

Protokoll:

Embriók preparálása

A legyeket, melyek utódait kívánjuk vizsgálni, szén és agar tartalmú táptalajon petéztetjük 4 órán át. Az embriókat ezután a megfelelő kor eléréséig szobahőmérsékleten tartjuk (kb. 13h).

Az embriókat a táptalajról desztillált vízzel lemosva nylon-on fogjuk fel, majd következő lépésben 2 percig hipóba (Clorox) áztatva őket, eltávolítjuk az embrió külső, korion-burkát. A dekorionizált embriókat desztillált vízzel mossuk, majd a felesleges vizet leitatva róluk, 3 ml N-heptánt tartalmazó szcintillációs üvegbe helyezzük át őket és 3 ml PBS-sel hígított 4%- os formaldehidet mérünk rá. A két fázis jól láthatóan elkülönül egymástól és a fázisok között helyezkednek el az embriók. Amíg a heptán telítődik a fixálószerrel, az embriók vitellin membránján is keresztül penetrál a formaldehid, így fixálja őket. A fixálás 20 percig tart, ezután eltávolítotjuk a formaldehides (alsó) fázist. Következő lépésként 1,5 térfogat -20°C-os metanolt mérünk az embriókra, és a két elkülönülő fázist 45 mp-ig folyamatosan, és erősen összerázzuk. E lépés során az embriók kb. 80%-nál felszakad az őket borító vitellin membrán, és a devitellinizált embriók az alsó (metanol) fázisba süllyednek. Azok az embriók, melyek vitellin membránja nem szakad fel, ill. az üres vitellin burkok a heptán és a metanol fázis határán maradnak, így a következő lépésben a heptán fázis leszívásával könnyen eltávolíthatóak. A devitellinizált embriókat Eppendorf csőbe tesszük át - a könnyebb kezelhetőség érdekében – és 3-szor mossuk metanollal. Ezután az embriókra 1 ml PBS : metanol (1:1) keveréket mérünk. 10 perc múlva a PBS : metanol-os oldatot eltávolítjuk, és PBS-T-vel (PBS, 0,1% Triton-X) 3-szor 10 percig mossuk az embriókat, majd PBS-BT-vel (PBS, 0,1% Triton-X, 0,2% BSA) minimum 1 h-t blokkoljuk. E lépés során a BSA telíti a fehérje-kötő helyeket, így az immunhisztokémiai eljárás alatt az antitest specifikusabban kötődik.

Embriók ellenanyagos festése

A blokkolt, devitellinizált embriókat over night (kb.18h) festjük 4°C-on PBS-BT-vel megfelelő koncentrációra kihígított elsődleges antitesttel, majd 5-ször 20 percig mossuk őket PBS-T-vel. Ezután megfelelő koncentrációra PBS-BT-vel kihígított fluoreszcens vagy biotinilált másodlagos ellenanyagot teszünk rájuk, és 2-3 h-t inkubáljuk szobahőmérsékleten. A fluoreszcens festésnél az inkubáció sötétben zajlik. Ezután 5- ször 30 percig mossuk őket.

A fluoreszcens festés utolsó lépéseiként először glicerin:PBS (1:1) keveréket mérünk az embriókra, majd miután az embriók az Eppendorf-cső aljára süllyednek, ezt gicerin:PBS (4:1)-re cseréljük. Ebben az embriók tárgylemezre tehetők, és fedőlemezzel lefedve mikroszkóp alatt vizsgálhatók.

A csapadék-képződéses festésnél 30 perccel a mosás lejárta előtt összemérjük a Vectastatin ABC reagenst - mely Avidin DH-t és Biotinilált közönséges tormaperoxidáz H-t tartalmaz – és szobahőmérsékleten hagytuk 30 percig. Az ez idő alatt kialakuló avidin-tormaperoxiáz komplex képes a biotinilált másodlagos ellenanyaghoz kötődni. A 30 perc letelte után az embriókra mérjük az ABC reagenst, majd ugyancsak 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk őket. Ezután az embriókat 5-ször 10 percig mossuk PBS-T-vel, majd egy előre összemért DAB (3,3'-Diaminobenzidine) - H2O2 reagenst mérünk rá. A reakció folyamán a tormaperoxidáz barna csapadékká alakítja a DAB-ot, mely specifikusan az ellenanyaggal megjelölt helyen jelenik meg, kirajzolva ezzel a számunkra érdekes struktúrákat. A csapadékképződést mikroszkóp alatt ellenőrizzük a túlhívás elkerülése érdekében, majd kb. 15-20 perc elteltével leszívjuk a DAB reagenst és PBS-sel leállítjuk a folyamatot. Az embriókat mossuk PBS-T-ben, és a fluoreszcens festési eljárásnál leírtak szerint átvezetjük őket glicerin:PBS (4:1)–be, majd ebben  boncoljuk ki mikroszkóp alatt az embrionális idegrendszert, melyet ezután tárgylemezre téve nagyobb nagyítású mikroszkóp alatt fotózhatunk.

Irodalomjegyzék:

Campos-Ortega J.A. és Hartenstein,V. (1997) Central Nervous System. In The Embryonic Development of Drosophila melanogaster Heidelberg: Springer-Verlag

Goodman,C.S. and Doe,C.Q. (1993). Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster, vol. II (ed. M. Bate and A. Martinez-Arias), pp. 1131-1206. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press