A muslica (Drosophila melanogaster) agya, mint idegrendszeri modell
A Drosophila
agy az egyedfejlődés három fejlődési stádiumán keresztül alakul ki, melyek név
szerint az embrionális, a lárvális és a báb stádium. A korai embrióban a
neuroblasztok egy populációja (elsődleges neuroblasztok) kiválik a neuroektodermából,
és létrehozza a glia- és idegsejteket (elsődleges glia- és idegsejtek), melyek
későbbi funkcionális lárva agyat fogják alkotni. Minden egyes neuroblaszt
osztódással létrehoz, egy utódsejt populációt, melyek egy ideig együtt
maradnak, nyúlványokat növesztenek, ezek a nyúlványok közös rostban futnak
(elsődleges axonköteg). A mitótikus nyugalmi fázis után, mely a késői
embriogenezistől a az első lárva stádium végéig tart, ugyanezek a
neuroblasztok keresztül mennek egy
második osztódáson. Az ebből az osztódásból származó neuronok (másodlagos
idegsejtek) azután morfológiai és funkcionális differenciáción mennek
keresztül, axont növesztenek, és létrehozzák a másodlagos axonkötegeket (1.
ábra). A báb fázis során a másodlagos idegsejtek megérnek, és a közben átalakult
elsődleges idegsejtekkel együtt alkotják az adult agyat.
1.ábra A lárvális Drosophila agy egyik hemiszférájának
sematikus keresztmetszeti képe.
Drosphilában
mind a lárvális, mind a felnőtt agy ganglion típusú. Az ideg- és gliasejtek
sejttestjei egy külső réteget (kérget) alkotnak a belső neuropil réteg körül, mely
mint nyúlvány-gazdag régió, axonokból, dedritekből és persze a közöttük
létrejött szinapszisokból áll (2. ábra). Mivel a neuropil régió gyakorlatilag
sejttest-mentes, rendkívüli módon kompakt struktúra.
2.ábra A Drosophila felnőtt agy keresztmetszeti képe. Piros színnel a nyúlvány gazdag neuropil régió
látható, zöld színnel a sejtmagokat jelöltük.
Mind a
lárvális, mind a felnőtt agy alkalmas modell a nyúlványnövekedés vizsgálatára.
A mutánsok idegi szövetének strukturális vizsgálatához először ki kell
boncolnunk a megfelelő korú agyakat, majd fixálás után immunhisztokémiai festéssel
láthatóvá tehetjük a számunkra érdekes nyúlványokat, agyi területeket. Például
az egyik legjobban tanulmányozott idegi képlet, a gombatest, a FasII nevű
ellenanyag használata mellett jól vizsgálható (3. ábra).
3. ábra A Drosophila felnőtt agy gombatest nevű
struktúrájában megjelenő nyúlványnövekedési és navigálási hibák, FasII
ellenanyagos festés mellett.
A lárvális és felnőtt agy boncolásáról itt látható két
rövid videó:
Protokoll:
Agy preparálása
Az agyakat
PBS-ben boncoljuk ki, majd szobahőmérsékleten 20 percig fixáljuk 4%-os (PBS-ben
oldott) paraformaldehiddel. A fixálás után a preparátumot 3x10 percig PBS-T-vel
mossuk, majd Eppendorf csőbe helyezzük, és PBS-BT-ben 1h-t szobahőmérsékleten
blokkoljuk. Az elsődleges ellenanyagot blokkolóban (PBS-BT) hígítjuk, rámérjük
a mintára és egy éjszakán át 4°C-on festjük a szövetet. Másnap mossuk az
agyakat 3-szor PBS-T-vel, majd a PBS-BT-ben kihígított másodlagos ellenanyaggal
festük egy órán át. A festés után 3-szor mossuk a mintákat PBS-T-vel, majd
glicerin:PBS (1:1) keveréket mérünk rá. Ha lesüllyedtek az Eppendorf cső aljára
az agyak, akkor leszívjuk róluk a folyadékot, és glicerin:PBS (4:1) keveréket
mérünk rájuk. Ebben rakjuk fel tárgylemezre, és mikroszkóp alatt vizsgáljuk.
Irodalomjegyzék:
Gerhard M.
Technau PhD (2008) Brain Development in Drosophila melanogaster. Advances in Experimental
Medicine and Biology, Volume 628.
