Az axonnövekedés és a növekedési kúp általános jellemzése

A komplex idegi működés alapja a megfelelő idegsejtek közötti kapcsolatok kialakulása. Ennek feltétele, hogy az idegsejtek nyúlványai megfelelő minta szerint projektáljanak, megtalálva a célsejtjüket. A növekvő axonok a környezeti jelek alapján választják ki növekedésük irányát, ami egy a növekvő axon és a környezete közötti kölcsönhatást feltételez. Ebben a folyamatban döntő szerepet játszanak az axonok végén differenciálódó növekedési kúpok (growth cone), melyek a növekvő axonvég kitágult képletei (1. ábra). A növekedési kúpok területén lamellipódiumokat találunk, melyek között vékony filopódiumok nyúlnak ki (1. ábra). A periférián található filopódiumok mintegy „csápként” tapogatják le a környezetüket, és a különböző vonzó és taszító jelekre reagálva határozzák meg az axon növekedési irányát. Ezt az teszi lehetővé, hogy egyrészt minden sejt felszínén megtalálhatóak a felismerésüket szolgáló adhéziós molekulák, másrészt az idegsejt nyúlványok célsejtjei a növekedési kúp által érzékelhető navigációs jeleket termelnek.

1. ábra  A növekedési kúp sematikus ábrája.

A navigációs jelek általában egy koncentráció grádiens mentén oszlanak el, és ily módon irányítják a növekvő axonokat. A vonzó és taszító navigációs jelek „tengerében” a növekedési kúpok képesek a számukra fontos jeleket érzékelni és dinamikus sejtalak, illetve sejtváz átrendeződésekkel aktív mozgást végezni akár több centiméteres távolságokra is, ami a funkcionális idegrendszer kialakulásának az alapja.

A növekedési kúp az axonok disztális (a sejttesttől távol eső) végén található, alakját tekintve igen dinamikusan változó legyező-szerű képlet, melynek funkciója a környezetből érkező jelek érzékelése, és ennek megfelelően a helyes idegi projekció biztosítása. Az axon növekedési kúpja három fő régióra tagolható, egyrészt a központi citoplazmikus állományra, mely organellumokban gazdag, egy átmeneti régióra és a perifériás részre, ahol lamellipódiumok és filopódiumok találhatóak (Luo,L.,2002). Az axonok növekedése során az ujjszerű (filopodiumok) és lemezszerű membránkitüremkedések (lamellipodiumok), illetve az ezeken elhelyezkedő receptorok játsszák a fő szerepet a jelmolekulák érzékelésében. Attól függően, hogy vonzó vagy taszító jellegű faktorral érintkeznek, változik a növekedési kúp aktuális alakja és növekszik az axon egy meghatározott irányba. A növekedési kúp másik fontos része a kevésbé dinamikusan változó centrális régió. Az átmeneti zóna az aktin-gazdag perifériás és a mikrotubulus-gazdag centrális régió között húzódó keskeny zóna. Ezen a területen zajlik az aktin depolimerizációja, itt találhatók meg legnagyobb mennyiségben az aktin depolimerizáló faktorok, mint például a Cofilin és a Gelsolin.

            A nyúlvány növekedése során a növekedési kúp egy szabályos érési folyamaton megy keresztül, amely többszörösen ismétlődik, egészen addig míg az axon teljesen ki nem alakul. Ezt a folyamatot három szakaszra lehet osztani, mégpedig a kidudorodás (protusion), a feltöltődés (engorgement) és az állandósulás (consolidation) szakaszaira (Dent és Gertler 2003; Goldberg és Burmeister,1986). A kidudorodás szakasza alatt a növekedési kúp membránja kitüremkedik, megjelennek új filopódiumok és lamellipódiumok, amiben fontos szerepet játszik a növekedési kúp aktin sejtvázának átalakulása az aktin filamentumok polimerizációja által (Letourneau, 1983; Okabe és Hirokawa, 1991). Ha a filopódium egy olyan jelet érzékel, mely számára taszító, akkor a növekedési kúpban a jeltől távoli helyen kezdődik az aktin polimerizáció, míg a taszító jel oldalán a filopódiumok és lamellipódiumpok leépülnek (Bentley és O’Connor, 1994; Dent és Gertler, 2003; Lin és mtsi,1993). A következő fázis a feltöltődés (engorgement), melynek folyamán a kidudorodott részek a Brown-mozgás és a mikrotubulus alapú transzport folyamatok következtében feltöltődnek vezikulumokkal és sejtorganellumokkal. Végül az utolsó fázis, az állandósulás (consolidation) során a növekedési kúp proximális része hengeres alakot vesz fel, az organellum transzport kétirányúvá válik, és kialakul egy új disztális rész az axonon (Dent és Gertler, 2003) (2. ábra). Ezeknek a lépéseknek a ciklikus ismétlődése addig tart, míg a nyúlvány el nem éri a célsejtet, ahol végül szinapszist képez, és terminálódik.

3. ábra  Az axonnövekedés fázisai

Eredeti ábra: Dent és Gertler, 2003

 Irodalomjegyzék:

Bentley, D., és O'Connor, T.P. (1994). Cytoskeletal events in growth cone steering. Curr Opin Neurobiol 4, 43-48.

Dent, E.W., és Gertler, F.B. (2003) Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron 40, 209-227

Goldberg, D.J., and Burmeister, D.W. (1986) Stages in axon formation: observations of growth of Aplysia axons in culture using video-enhanced contrast-differential interference contrast microscopy. The Journal of Cell Biology 103, 1921-1931.

Letoumeau, P. C. (1983).Differences in the organization of actin in the growth cones compared with the neurites of cultured neurons from chick embryos. J. Cell Biol. 97: 963-973. 

Lin, C.H., and Forscher, P. (1993) Cytoskeletal remodeling during growth cone-target interactions. J Cell Biol 121, 1369-1383.

Luo L. (2002) Actin cytoskeleton regulation in neuronal morphogenesis and structural plasticity. Annu Rev Cell Dev Biol. 18, 601-35.

Okabe, S., and Hirokawa, N. (1991). Actin dynamics in growth cones. Int. Rev. Cytol. 178, 207–275. J. Neurosci. 11, 1918–1929.

  

A MARCM rendszer

Ha egy állat különböző genotípusú szomatikus sejtekkel rendelkezik, mozaikosnak nevezzük. Transzgenikus mozaikos állat létrehozásával képesek vagyunk vizsgálni egy olyan gén szövet-specifikus hiányának következményét, melynek jelenléte az állat egyedfejlődéséhez nélkülözhetetlen, és a homozigóta mutáns állat még a vizsgálni kívánt szövet kialakulása előtt elpusztul. Ez a módszer ezen felül alkalmas a sejtleszármazás nyomon követésére is.

A mozaik analízisnek több stratégiája létezik, de mi most az idegrendszeri vizsgálatok során előszeretettel alkalmazott MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) analízissel fogunk foglalkozni. Ezzel a homológ rekombináción alapuló módszerrel egy pozitívan jelölt klónt tudunk létrehozni. A MARCM analízis nagyon jól használható idegi vizsgálatokhoz, segítségével végig tudjuk követni, hogy egy idegsejt mely területet hálózza be, de ezzel a módszerrel feltérképezhetjük pontosan az adott terület teljes idegi hálózatát is. E mellett természetesen a módszer segítségével képesek vagyunk a homozigóta formában letális (tehát nem életképes) mutációk hatását szövet specifikusan vizsgálni, mely során a mutáns idegsejtek teljes nyúlványmintázata kirajzolódik.

          A rendszer a homológ rekombináción alapszik, így tartalmaz egy homológ rekombinációs helyet (FRT - Frequent Recombination Target), mely egy specifikus DNS szekvencia, ami a flip (FLP) rekombináz enzim specifikus célszekvenciája. Ha mindkét homológ kromoszóma ugyanazon a helyen tartalmazza az FRT szekvenciát, akkor a mitótikus osztódás során a párosodott homológ kromoszómák között FLP jelenlétében megtörténik a mitótikus rekombináció, melynek eredményeképpen az adott kromoszóma karra (melyen az FRT szekvencia van) nézve heterozigóta sejt utódsejtjei homozigóták lesznek. A vizsgálni kívánt mutációnak mindig egy FRT szekvenciát hordozó kromoszóma karon kell elhelyezkednie, míg a homológ kromoszómán hasonlóképpen egy FRT szekvenciát hordozó kromoszómakaron egy represszor fehérjét termelő transzgén (Gal80) foglal helyet. Az FRT szekvenciák mindig a centromer és a transzgén/mutáció között helyezkednek el. Ezáltal a homológ rekombináció során keletkezik egy olyan sejt, amely homozigóta a mutáns allélra, és nem tartalmazza a represszor azaz gátló (Gal80) fehérjét, illetve egy olyan sejt mely homozigóta a represszor fehérjére és nem tartalmazza a mutáns allélt, így a mutációra nézve vad típusú (1. ábra).

1.ábra A MARCM rendszer működése.

A sejtek jelölése a Gal4-UAS rendszer segítségével történik. Ez a rendszer egy élesztő eredetű rendszer, így csak abban az esetben található meg Drosophilában, ha transzgénként bevisszük. A rendszer lényege, hogy a Gal4 szabályozó fehérje az UAS (upstream activating sequence) szekvenciához kapcsolódva aktiválja az UAS szekvencia mögé ültetett gén átírását. Drosophilában a Gal4 fehérjét kódoló gén expresszióját szövet-specifikus promóterek szabályozzák, ezáltal képesek vagyunk szövet-specifikusan túltermelni bizonyos UAS szekvencia mögé ültetett transzgéneket, illetve az általuk kódolt fehérjéket. A MARCM rendszer esetében ez a gén az mCD8-GFP fúziós fehérjét kódolja, mely abban az esetben ha átíródik, membrán kötött fehérjeként jelen lesz a teljes idegsejt plazmamembránjában. A GFP (Green Fluorescent Protein) fehérje UV (396 nm) fénnyel gerjesztve, 508 nm-es zöld fényt bocsát ki, így fluoreszcens mikroszkóp alatt az mCD8-GFP-vel jelölt idegsejtek jól vizsgálhatók. (2. ábra)

2.ábra Egy sejtet érintő MARCM klónok 

forrás: http://www.janelia.org

Az UAS-GAl4 rendszer represszor (gátló) fehérjéje a Gal80, mely a Gal4 fehérjéhez kötődve gátolja annak aktiváló hatását a transzkripcióra. A MARCM rendszerben a Gal80 fehérje génje egy általánosan kifejeződő gén promótere mögé van ültetve, így a fehérje minden szövetben jelen lesz. A nem klónos állatok összes sejtje heterozigóta mind a mutáns allélre, mind a represszor fehérje génjére nézve, így az állat egyetlen sejtje sem termel mCD8-GFP fehérjét, tehát az állat UV fénnyel megvilágítva, nem fluoreszkál zölden. Ahhoz, hogy a GFP fehérje megjelenjen egy sejtben szükséges, hogy az utódsejt ne tartalmazza a represszor fehérjét. Ez csak abban az esetben következik be, ha az osztódó heterozigóta sejtben végbe megy az FRT régiók közötti hely-specifikus rekombináció. A rekombináció végbe meneteléhez szükség van a FLP enzimre, mely ebben a rendszerben egy hősokk promóter mögé van ültetve, így a megfelelő fejlődési időpontot kiválasztva (általunk vizsgálni kívánt sejtek létrejötte), hősokkoljuk (1/2 - 1 óra 37°C-on) az állatokat, ezáltal megfelelő sejtek osztódásakor FLP enzimet termeltetünk a sejtekkel, így az aktuálisan osztódó sejtekben végbemegy a homológ rekombináció. Az ebből az osztódásból származó utódsejtek közül az egyik homozigóta mutáns klón lesz, mely továbbiakban nem termeli tovább a represszor fehérjét, így egy idő után (a sejtben maradt Gal80 fehérjék életidejének lejárta, és lebomlása után) beindulhat a Gal4-UAS rendszer, és a mutáns sejt mCD8-GFP fehérjét fog termelni, tehát UV fénnyel megvilágítva zölden fog fluoreszkálni. Az osztódásból származó másik sejt a mutációra nézve vad típusú lesz, emellett homozigóta lesz a represszor fehérjét kódoló transzgénre így nem fog mCD8-GFP-t termelni.

Az idegi differenciálódás során a neuroblasztok (Nb) inekvális osztódásuk során létrehoznak egy másik neuroblasztot, és egy ganglion anyasejtet (G), majd a ganglion anyasejt ekvális osztódásával keletkeznek a neuronok (N). Attól függően, hogy melyik sejt osztódása során termelődik a FLP enzim, több féle klón létre jöhet. Ha a neuroblaszt osztódása során történik a rekombináció, akkor attól függően, hogy melyik utódsejt lesz homozigóta a mutációra, megkülönböztetünk többsejtes neuroblaszt klónt és kétsejtes klónt. A neuroblaszt klón esetében homozigóta mutáns neuroblaszt sejt jön létre, melynek továbbiakban minden utódsejtje mutáns lesz, míg a kétsejtes klón esetében a ganglion anyasejt és az abból származó két neuron lesz homozigóta mutáns. Egysejtes klón abban az esetben jön létre, ha a helyspecifikus rekombináció a ganglion anyasejt osztódása során történik meg, így csak az egyik neuron lesz homozigóta a mutációra nézve (3. ábra).

3.ábra MARCM klón-típusok 

Az, hogy mely sejtek fognak pozitívan jelölődni a Gal4 driver-től függ. Ha például egy gomba-test specifikus drivert használunk, akkor a klónokat a gombatest területén találjuk, ha azonban egy általános idegrendszeri drivert alkalmazunk, az egész idegrendszerben megfigyelhetjük a homozigóta mutáns klónokat. Ez természetesen azt jelenti, hogy a rekombináció az állat minden osztó szövetében végbe megy, pozitívan jelölve azonban csak a számunkra érdekes szövetekben/idegsejtekben lesz, így a szövet sejtjei könnyen vizsgálhatóak.

Irodalomjegyzék:

Lee, T; Luo, L (2001). Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences 24 (5): 251–4.

A gombatest szerkezete és kialakulása

A gombatest (mushroom body /MB/) (1.ábra) egyike a Drosophila agy egyik legjobban elkülöníthető területeinek, és sztereotíp nyúlványmintája miatt az axonnövekedési vizsgálatok kedvelt modell rendszere. Több kutatás bebizonyította, hogy fontos szerepet játszik a szaglási tanulásban. A gombatest szerkezetében bekövetkezett elváltozások hatására sérül az állat hosszú- és rövidtávú memóriája. A szaglási tanulás mellett azonban a gombatestnek még számos más funkciót is tulajdonítanak, mint például a mozgási aktivitás szabályozása, az alvás, a vizuális memória összetett formája, a helypreferencia, stb.

1.ábra  A gombatest helyzete a muslica fejében

            A Drosophila gombateste három fő részből áll, a kehelyből, a nyélből és a lebenyekből. Alapfelépítését az őt alkotó Kenyon sejtek adják, melyekből gombatestenként kb. 2500 darab van. Ezen sejtek nyúlványai anterior irányba projektálva dendritikus ágakat képeznek, melyek összessége alkotja a kelyhet, majd a nyúlványok tovább projektálva hozzák létre a nyelet. A nyél elülső végénél az axonok elágazódnak, majd dorzálisan és mediálisan tovább növekedve kialakítják a vertikális és mediális lebenyeket. A vertikális lebenyek az α’ és α lebenyekből, míg a mediális lebenyek a γ, a β’ és a β lebenyekből állnak. A Kenyon sejteknek három típusát különböztetjük meg, melyek nemcsak abban térnek el egymástól, hogy mely lebenyek kialakításában vesznek részt, de génexpresziós mintázatuk is eltérő. A γ neuronok csak a γ lebenyt idegzik be, mely a leganteriorálisabb része a mediális lebenynek. Az α’/β’ neuronok elágaznak a nyél anteriorális végénél és az α’ és a β’ lebenyebe projektálnak. Az α/β neuronok is ezt a mintázatot követik, és elágazódva az α és a β lebenyekben végződnek. (2.ábra)

2.ábra  A gombatest felépítése

A három Kenyon sejt típus és az általuk létrehozott lebenyek a fejlődés során egymás után keletkeznek. Először a γ neuronok jönnek létre és egészen az L3-as stádiumig csak ezek alkotják a fejlődő gombatestet. Másodikként az α’/β’ neuronok jelennek meg a késői lárva stádiumban, végezetül az α/β neuronok jönnek létre a neuroblasztok osztódásából, melyek száma egészen a késői báb stádiumig egyre nő. A fejlődés során legelőször megjelenő Kenyon-sejtek (a γ neuronok) nyúlványai lárvális projekciójuk során kettéágaznak, létrehozva a vertikális és a mediális lebenyeket, de ezek az axonok csak ideiglenesek, mivel egyik funkciójuk, hogy a később projektáló α’/β’ neuronok nyúlványai számára szolgáljanak segítségül a növekedés során, kijelölve az útvonalat. Az L3 lárva stádium végén kezdenek el projektálni az α’/β’ neuronok nyúlványai a γ lebenyek közepén, majd az agy elülső részébe érve – követve a γ axonok mintázatát – létrehozzák az α’ és a β’ lebenyeket. A bábozódás kezdetén, miután α’/β’ nyúlványok létrehozták az α’ és a β’ lebenyeket, a γ neuronok nyúlványai visszametsződnek a gliasejtek fagocitózisának köszönhetően. A visszametsződött axonok továbbiakban csak mediálisan nőnek vissza, létrehozva a felnőtt állatra jellemző γ lebenyt. Végezetül a báb stádium folyamán, miután az a’/β’ neuronok kialakultak, és létrehozták a rájuk jellemző lebenyeket, a neuroblasztok osztódása során létrejönnek az α/β neuronok, melyek nyúlványai a korábban kialakított minta mentén projektálnak és hozzák létre az α és β lebenyeket (3.ábra). Az újonnan létrejött nyúlványok, növekedésük során mindig a nyúlvány-köteg belsejében futnak, így biztosítva a megfelelő projekciót.

3.ábra A gombatest lebenyeinek kialakulása a különböző fejlődési stádiumok alatt. 

Irodalomjegyzék:

Awasaki T, Ito K. (2004) Engulfing action of glial cells is required for programmed axon pruning during Drosophila metamorphosis. Curr Biol 14:668–677.

Awasaki T, Tatsumi R, Takahashi K, Arai K, Nakanishi Y, Ueda R, Ito K. (2006) Essential role of the apoptotic cell engulfment genes draper and ced-6 in programmed axon pruning during Drosophila metamorphosis. Neuron 50:855–867.

Balling A, Technau GM, Heisenberg M. (1987) Are the structural changes in adult Drosophila mushroom bodies memory traces? Studies on biochemical learning mutants. J Neurogenet 4:65–73.

Brembs B, Wiener J. (2006) Context and occasion setting in Drosophila visual learning. Learn Mem 13:618–628.

Crittenden JR, Skoulakis EMC, Han K, Kalderon D, Davis RL. (1998) Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem 5:38–51.

Davis RL. (2004) Olfactory learning. Neuron 76:44:31–48.

Heisenberg M, Borst A, Wagner S, Byers D. (1985) Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J Neurogenet 2:1–30.

Heisenberg M. (2003) Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci 4:266–275

Joiner WJ, Crocker A, White BH, Sehgal A. (2006) Sleep in Drosophila is regulated by adult mushroom bodies. Nature 441:757–760.

Liu L, Wolf R, Ernst R, Heisenberg M. (1999) Context generalization in Drosophila visual learning requires the mushroom bodies. Nature 400: 753–756

Martin JR, Ernst R, Heisenberg M. (1998). Mushroom bodies suppress locomotor activity in Drosophila melanogaster. Learn Mem 5:179–191

Mizunami M, Weibrecht JM, Strausfeld NJ. (1998) Mushroom bodies of the cockroach: their participation in place memory. J Comp Neurol 402:520–53

Pascual A, Preat T. (2001) Localization of long-term memory within the Drosophila mushroom body. Science 294:1115–1117

Pitman JL, McGill JJ, Keegan KP, Allada R. (2006) A dynamic role for the mushroom bodies in promoting sleep in Drosophila. Nature 441:753–756.

  

Tang S, Guo A. 2001. Choice behavior of Drosophila facing contradictory visual cues. Science 294:1543–1547.

Technau GM. 1984. Fiber number in the mushroom bodies of adult Drosophila melanogaster depends on age, sex and experience. J Neurogenet 1:113–126

Verkhusha, V.V., Otsuna, H., Awasaki, T., Oda, H., Tsukita, S., and Ito, K. (2001). An Enhanced Mutant of Red Fluorescent Protein DsRed for Double Labeling and Developmental Timer of Neural Fiber Bundle Formation. Journal of Biological Chemistry 276, 29621-29624.

A muslica (Drosophila melanogaster) agya, mint idegrendszeri modell

A Drosophila agy az egyedfejlődés három fejlődési stádiumán keresztül alakul ki, melyek név szerint az embrionális, a lárvális és a báb stádium. A korai embrióban a neuroblasztok egy populációja (elsődleges neuroblasztok) kiválik a neuroektodermából, és létrehozza a glia- és idegsejteket (elsődleges glia- és idegsejtek), melyek későbbi funkcionális lárva agyat fogják alkotni. Minden egyes neuroblaszt osztódással létrehoz, egy utódsejt populációt, melyek egy ideig együtt maradnak, nyúlványokat növesztenek, ezek a nyúlványok közös rostban futnak (elsődleges axonköteg). A mitótikus nyugalmi fázis után, mely a késői embriogenezistől a az első lárva stádium végéig tart, ugyanezek a neuroblasztok  keresztül mennek egy második osztódáson. Az ebből az osztódásból származó neuronok (másodlagos idegsejtek) azután morfológiai és funkcionális differenciáción mennek keresztül, axont növesztenek, és létrehozzák a másodlagos axonkötegeket (1. ábra). A báb fázis során a másodlagos idegsejtek megérnek, és a közben átalakult elsődleges idegsejtekkel együtt alkotják az adult agyat.

1.ábra A lárvális Drosophila agy egyik hemiszférájának sematikus keresztmetszeti képe.

Drosphilában mind a lárvális, mind a felnőtt agy ganglion típusú. Az ideg- és gliasejtek sejttestjei egy külső réteget (kérget) alkotnak a belső neuropil réteg körül, mely mint nyúlvány-gazdag régió, axonokból, dedritekből és persze a közöttük létrejött szinapszisokból áll (2. ábra). Mivel a neuropil régió gyakorlatilag sejttest-mentes, rendkívüli módon kompakt struktúra.

2.ábra A Drosophila felnőtt agy keresztmetszeti képe. Piros színnel a nyúlvány gazdag neuropil régió látható, zöld színnel a sejtmagokat jelöltük.

Mind a lárvális, mind a felnőtt agy alkalmas modell a nyúlványnövekedés vizsgálatára. A mutánsok idegi szövetének strukturális vizsgálatához először ki kell boncolnunk a megfelelő korú agyakat, majd fixálás után immunhisztokémiai festéssel láthatóvá tehetjük a számunkra érdekes nyúlványokat, agyi területeket. Például az egyik legjobban tanulmányozott idegi képlet, a gombatest, a FasII nevű ellenanyag használata mellett jól vizsgálható (3. ábra).

3. ábra A Drosophila felnőtt agy gombatest nevű struktúrájában megjelenő nyúlványnövekedési és navigálási hibák, FasII ellenanyagos festés mellett.

A lárvális és felnőtt agy boncolásáról itt látható két rövid videó:

http://youtu.be/Hy3gwiyaTKA

http://youtu.be/u15xNrvNkPM

Protokoll:

Agy preparálása

Az agyakat PBS-ben boncoljuk ki, majd szobahőmérsékleten 20 percig fixáljuk 4%-os (PBS-ben oldott) paraformaldehiddel. A fixálás után a preparátumot 3x10 percig PBS-T-vel mossuk, majd Eppendorf csőbe helyezzük, és PBS-BT-ben 1h-t szobahőmérsékleten blokkoljuk. Az elsődleges ellenanyagot blokkolóban (PBS-BT) hígítjuk, rámérjük a mintára és egy éjszakán át 4°C-on festjük a szövetet. Másnap mossuk az agyakat 3-szor PBS-T-vel, majd a PBS-BT-ben kihígított másodlagos ellenanyaggal festük egy órán át. A festés után 3-szor mossuk a mintákat PBS-T-vel, majd glicerin:PBS (1:1) keveréket mérünk rá. Ha lesüllyedtek az Eppendorf cső aljára az agyak, akkor leszívjuk róluk a folyadékot, és glicerin:PBS (4:1) keveréket mérünk rájuk. Ebben rakjuk fel tárgylemezre, és mikroszkóp alatt vizsgáljuk.

Irodalomjegyzék:

Gerhard M. Technau PhD (2008) Brain Development in Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 628.

A muslica (Drosophila melanogaster) embrionális központi idegrendszerének használata a nyúlványnövekedés vizsgálatához

A muslicát, mint modellorganizmust előszeretettel használják az idegrendszer fejlődésének vizsgálatára, ezen belül is az egyik általánosan használt idegszövet az embrionális központi idegrendszer.

A muslicák embrionális idegrendszere a neuroektodermából alakul ki, olyan ektodermális sejtekből, melyeknek megvan a képességük arra, hogy idegsejteket és epidermiszt alakítsanak ki. A ventrális neurogén régió hozza létre a hasi idegköteg neuroblasztjait, mely a központi idegrendszer részeként a szegmentált csírasávhoz tartozik. Az agyi struktúra kialakításáért a feji neurogén régió a felelős. Az ektoderma neurogén régiója nemcsak neuroblasztokat, hanem epidermális prekurzorokat is tartalmaz, melyek a későbbiekben a ventrális epidermiszt, és a fej epidermiszét alakítják ki. A hasi neurogén régió tekintetében a delaminációban hemiszegmentenként 30 sejt vesz részt (neuroblasztok), a többi sejt a hasi epidermiszt alakítja ki. A neuroblasztok őssejtként osztódva kb. öt osztódási cikluson mennek keresztül, létrehozva a gaglion anyasejteket. Minden ganglion anyasejt keresztülmegy egy ekvális osztódáson, melynek eredményeképpen 2 neuron jön létre, kialakítva ezzel a hemiszegmentenkénti kb. 200 embrionális neuront (1. ábra).

1. ábra Neurogenezis a Drosophila embrióban. A neuroektoderma sejtek (NE, sárga) delaminációjával létrejönnek a neuroblasztok (NB, zöld). Minden NB őssejt módjára osztódva ganglion anyasejteket (GMC/ganglion mother cells/, narancssárga) hoz létre, melyek osztódásával jönnek létre az idegsejtek (n, piros).

Az idegsejtek terminális differenciálódása az embriogenezis 13. stádiumában kezdődik. Neuronok egy csoportjában kialakulnak az első nyúványok a központi idegrendszer felszínén. Később ezen pionír pályák mentén fognak futni a később differenciálódó neuronok axonjai. Ezek a nyúlványok rendkívül jellegzetes, létra alakú kötegekbe rendeződnek, melyek a szegmenteket összekötő hosszanti kötegekből, ill. az embrionális idegrendszer két oldalán kialakuló hosszanti kötegeket összekötő keresztkötegekből (komisszúrákból) állnak (2.ábra). A keresztkötegek száma szegmentenként kettő, és mind a keresztkötegek, mind a hosszanti kötegek tartalmazzák interneuronok és motoneuronok nyúványait is. A központi idegrendszer területéről kilépő motoneuron axonok minden szegmenten belül egy elülső (interszegmentális ideg) és egy hátulsó pálya (szegmentális ideg) mentén hagyják el a hasi idegkötegeket. A perifériáról a központba tartó érzőidegek szintén az imént említett pályák mentén haladnak.

Az embriogenezis utolsó stádiumai során a hasi idegkötegek megrövidülnek és kondenzálódnak, így az embrionális fejlődés végén a központi idegrendszer egy agyi és egy az embrió teljes hosszát végig nem érő hasi idegkötegre különül (2. ábra) (összefoglalva: Campos-Ortega J.A. és Hartenstein, 1997; Goodman,C.S. és Doe,C.Q., 1993).

2. ábra 17.stádiumú Drosophila embrió központi idegrendszerének sematikus képe

Az nyúlványnövekedésben szerepet játszó gének vizsgálatára a hasi idegköteg igen alkalmas. A hosszanti és keresztkötegek által kialakított „létraszerű” nyúlványmintázat egy általános nyúlvány-specifikus ellenanyag, a BP102 (DSHB) használatával könnyen láthatóvá tehető (3. ábra). A mutáns állatok vizsgálata során megfigyelhető mintázatbeli változás (szakadás, hiány, vastagodás) alapján következtethetünk az adott gén nyúlványnövekedés során betöltött funkciójára.

3. ábra Az általános nyúlvány-specifikus marker (BP102) mintázata az embrionális központi idegrendszer területén

A mutánsok vizsgálatához meghatározott korú (16. -17. stádiumú) embriókat használunk, melyek hasi idegkötege már megrövidült, így jól láthatóvá válnak az esetleges nyúlványmintázatot érintő elváltozások. A vizsgálatok során általánosan használt a csapadékos (3,3'-Diaminobenzidine (DAB) felhasználásával történő) előhívás, mely a mutáns analízis során nem teszi szükségessé a fluoreszcens mikroszkóp használatát (4. ábra). 

4. ábra Vad típusú (A) és mutáns embriók (B-D) központi idegrendszerének nyúlványmintázata BP102 ellenanyag használatával, csapadékos (DAB) előhívás mellett

Ahhoz azonban, hogy ezekről a hasi idegkötegekről jó minőségű felvételt tudjunk készíteni, ajánlott az idegi szövet kiboncolása, melyről a következő linken elérhető egy rövid bemutató videó: 

https://www.youtube.com/watch?v=rDeJVs2THjI

Protokoll:

Embriók preparálása

A legyeket, melyek utódait kívánjuk vizsgálni, szén és agar tartalmú táptalajon petéztetjük 4 órán át. Az embriókat ezután a megfelelő kor eléréséig szobahőmérsékleten tartjuk (kb. 13h).

Az embriókat a táptalajról desztillált vízzel lemosva nylon-on fogjuk fel, majd következő lépésben 2 percig hipóba (Clorox) áztatva őket, eltávolítjuk az embrió külső, korion-burkát. A dekorionizált embriókat desztillált vízzel mossuk, majd a felesleges vizet leitatva róluk, 3 ml N-heptánt tartalmazó szcintillációs üvegbe helyezzük át őket és 3 ml PBS-sel hígított 4%- os formaldehidet mérünk rá. A két fázis jól láthatóan elkülönül egymástól és a fázisok között helyezkednek el az embriók. Amíg a heptán telítődik a fixálószerrel, az embriók vitellin membránján is keresztül penetrál a formaldehid, így fixálja őket. A fixálás 20 percig tart, ezután eltávolítotjuk a formaldehides (alsó) fázist. Következő lépésként 1,5 térfogat -20°C-os metanolt mérünk az embriókra, és a két elkülönülő fázist 45 mp-ig folyamatosan, és erősen összerázzuk. E lépés során az embriók kb. 80%-nál felszakad az őket borító vitellin membrán, és a devitellinizált embriók az alsó (metanol) fázisba süllyednek. Azok az embriók, melyek vitellin membránja nem szakad fel, ill. az üres vitellin burkok a heptán és a metanol fázis határán maradnak, így a következő lépésben a heptán fázis leszívásával könnyen eltávolíthatóak. A devitellinizált embriókat Eppendorf csőbe tesszük át - a könnyebb kezelhetőség érdekében – és 3-szor mossuk metanollal. Ezután az embriókra 1 ml PBS : metanol (1:1) keveréket mérünk. 10 perc múlva a PBS : metanol-os oldatot eltávolítjuk, és PBS-T-vel (PBS, 0,1% Triton-X) 3-szor 10 percig mossuk az embriókat, majd PBS-BT-vel (PBS, 0,1% Triton-X, 0,2% BSA) minimum 1 h-t blokkoljuk. E lépés során a BSA telíti a fehérje-kötő helyeket, így az immunhisztokémiai eljárás alatt az antitest specifikusabban kötődik.

Embriók ellenanyagos festése

A blokkolt, devitellinizált embriókat over night (kb.18h) festjük 4°C-on PBS-BT-vel megfelelő koncentrációra kihígított elsődleges antitesttel, majd 5-ször 20 percig mossuk őket PBS-T-vel. Ezután megfelelő koncentrációra PBS-BT-vel kihígított fluoreszcens vagy biotinilált másodlagos ellenanyagot teszünk rájuk, és 2-3 h-t inkubáljuk szobahőmérsékleten. A fluoreszcens festésnél az inkubáció sötétben zajlik. Ezután 5- ször 30 percig mossuk őket.

A fluoreszcens festés utolsó lépéseiként először glicerin:PBS (1:1) keveréket mérünk az embriókra, majd miután az embriók az Eppendorf-cső aljára süllyednek, ezt gicerin:PBS (4:1)-re cseréljük. Ebben az embriók tárgylemezre tehetők, és fedőlemezzel lefedve mikroszkóp alatt vizsgálhatók.

A csapadék-képződéses festésnél 30 perccel a mosás lejárta előtt összemérjük a Vectastatin ABC reagenst - mely Avidin DH-t és Biotinilált közönséges tormaperoxidáz H-t tartalmaz – és szobahőmérsékleten hagytuk 30 percig. Az ez idő alatt kialakuló avidin-tormaperoxiáz komplex képes a biotinilált másodlagos ellenanyaghoz kötődni. A 30 perc letelte után az embriókra mérjük az ABC reagenst, majd ugyancsak 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk őket. Ezután az embriókat 5-ször 10 percig mossuk PBS-T-vel, majd egy előre összemért DAB (3,3'-Diaminobenzidine) - H2O2 reagenst mérünk rá. A reakció folyamán a tormaperoxidáz barna csapadékká alakítja a DAB-ot, mely specifikusan az ellenanyaggal megjelölt helyen jelenik meg, kirajzolva ezzel a számunkra érdekes struktúrákat. A csapadékképződést mikroszkóp alatt ellenőrizzük a túlhívás elkerülése érdekében, majd kb. 15-20 perc elteltével leszívjuk a DAB reagenst és PBS-sel leállítjuk a folyamatot. Az embriókat mossuk PBS-T-ben, és a fluoreszcens festési eljárásnál leírtak szerint átvezetjük őket glicerin:PBS (4:1)–be, majd ebben  boncoljuk ki mikroszkóp alatt az embrionális idegrendszert, melyet ezután tárgylemezre téve nagyobb nagyítású mikroszkóp alatt fotózhatunk.

Irodalomjegyzék:

Campos-Ortega J.A. és Hartenstein,V. (1997) Central Nervous System. In The Embryonic Development of Drosophila melanogaster Heidelberg: Springer-Verlag

Goodman,C.S. and Doe,C.Q. (1993). Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster, vol. II (ed. M. Bate and A. Martinez-Arias), pp. 1131-1206. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press