A MARCM rendszer

Ha egy állat különböző genotípusú szomatikus sejtekkel rendelkezik, mozaikosnak nevezzük. Transzgenikus mozaikos állat létrehozásával képesek vagyunk vizsgálni egy olyan gén szövet-specifikus hiányának következményét, melynek jelenléte az állat egyedfejlődéséhez nélkülözhetetlen, és a homozigóta mutáns állat még a vizsgálni kívánt szövet kialakulása előtt elpusztul. Ez a módszer ezen felül alkalmas a sejtleszármazás nyomon követésére is.

A mozaik analízisnek több stratégiája létezik, de mi most az idegrendszeri vizsgálatok során előszeretettel alkalmazott MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) analízissel fogunk foglalkozni. Ezzel a homológ rekombináción alapuló módszerrel egy pozitívan jelölt klónt tudunk létrehozni. A MARCM analízis nagyon jól használható idegi vizsgálatokhoz, segítségével végig tudjuk követni, hogy egy idegsejt mely területet hálózza be, de ezzel a módszerrel feltérképezhetjük pontosan az adott terület teljes idegi hálózatát is. E mellett természetesen a módszer segítségével képesek vagyunk a homozigóta formában letális (tehát nem életképes) mutációk hatását szövet specifikusan vizsgálni, mely során a mutáns idegsejtek teljes nyúlványmintázata kirajzolódik.

          A rendszer a homológ rekombináción alapszik, így tartalmaz egy homológ rekombinációs helyet (FRT - Frequent Recombination Target), mely egy specifikus DNS szekvencia, ami a flip (FLP) rekombináz enzim specifikus célszekvenciája. Ha mindkét homológ kromoszóma ugyanazon a helyen tartalmazza az FRT szekvenciát, akkor a mitótikus osztódás során a párosodott homológ kromoszómák között FLP jelenlétében megtörténik a mitótikus rekombináció, melynek eredményeképpen az adott kromoszóma karra (melyen az FRT szekvencia van) nézve heterozigóta sejt utódsejtjei homozigóták lesznek. A vizsgálni kívánt mutációnak mindig egy FRT szekvenciát hordozó kromoszóma karon kell elhelyezkednie, míg a homológ kromoszómán hasonlóképpen egy FRT szekvenciát hordozó kromoszómakaron egy represszor fehérjét termelő transzgén (Gal80) foglal helyet. Az FRT szekvenciák mindig a centromer és a transzgén/mutáció között helyezkednek el. Ezáltal a homológ rekombináció során keletkezik egy olyan sejt, amely homozigóta a mutáns allélra, és nem tartalmazza a represszor azaz gátló (Gal80) fehérjét, illetve egy olyan sejt mely homozigóta a represszor fehérjére és nem tartalmazza a mutáns allélt, így a mutációra nézve vad típusú (1. ábra).

1.ábra A MARCM rendszer működése.

A sejtek jelölése a Gal4-UAS rendszer segítségével történik. Ez a rendszer egy élesztő eredetű rendszer, így csak abban az esetben található meg Drosophilában, ha transzgénként bevisszük. A rendszer lényege, hogy a Gal4 szabályozó fehérje az UAS (upstream activating sequence) szekvenciához kapcsolódva aktiválja az UAS szekvencia mögé ültetett gén átírását. Drosophilában a Gal4 fehérjét kódoló gén expresszióját szövet-specifikus promóterek szabályozzák, ezáltal képesek vagyunk szövet-specifikusan túltermelni bizonyos UAS szekvencia mögé ültetett transzgéneket, illetve az általuk kódolt fehérjéket. A MARCM rendszer esetében ez a gén az mCD8-GFP fúziós fehérjét kódolja, mely abban az esetben ha átíródik, membrán kötött fehérjeként jelen lesz a teljes idegsejt plazmamembránjában. A GFP (Green Fluorescent Protein) fehérje UV (396 nm) fénnyel gerjesztve, 508 nm-es zöld fényt bocsát ki, így fluoreszcens mikroszkóp alatt az mCD8-GFP-vel jelölt idegsejtek jól vizsgálhatók. (2. ábra)

2.ábra Egy sejtet érintő MARCM klónok 

forrás: http://www.janelia.org

Az UAS-GAl4 rendszer represszor (gátló) fehérjéje a Gal80, mely a Gal4 fehérjéhez kötődve gátolja annak aktiváló hatását a transzkripcióra. A MARCM rendszerben a Gal80 fehérje génje egy általánosan kifejeződő gén promótere mögé van ültetve, így a fehérje minden szövetben jelen lesz. A nem klónos állatok összes sejtje heterozigóta mind a mutáns allélre, mind a represszor fehérje génjére nézve, így az állat egyetlen sejtje sem termel mCD8-GFP fehérjét, tehát az állat UV fénnyel megvilágítva, nem fluoreszkál zölden. Ahhoz, hogy a GFP fehérje megjelenjen egy sejtben szükséges, hogy az utódsejt ne tartalmazza a represszor fehérjét. Ez csak abban az esetben következik be, ha az osztódó heterozigóta sejtben végbe megy az FRT régiók közötti hely-specifikus rekombináció. A rekombináció végbe meneteléhez szükség van a FLP enzimre, mely ebben a rendszerben egy hősokk promóter mögé van ültetve, így a megfelelő fejlődési időpontot kiválasztva (általunk vizsgálni kívánt sejtek létrejötte), hősokkoljuk (1/2 - 1 óra 37°C-on) az állatokat, ezáltal megfelelő sejtek osztódásakor FLP enzimet termeltetünk a sejtekkel, így az aktuálisan osztódó sejtekben végbemegy a homológ rekombináció. Az ebből az osztódásból származó utódsejtek közül az egyik homozigóta mutáns klón lesz, mely továbbiakban nem termeli tovább a represszor fehérjét, így egy idő után (a sejtben maradt Gal80 fehérjék életidejének lejárta, és lebomlása után) beindulhat a Gal4-UAS rendszer, és a mutáns sejt mCD8-GFP fehérjét fog termelni, tehát UV fénnyel megvilágítva zölden fog fluoreszkálni. Az osztódásból származó másik sejt a mutációra nézve vad típusú lesz, emellett homozigóta lesz a represszor fehérjét kódoló transzgénre így nem fog mCD8-GFP-t termelni.

Az idegi differenciálódás során a neuroblasztok (Nb) inekvális osztódásuk során létrehoznak egy másik neuroblasztot, és egy ganglion anyasejtet (G), majd a ganglion anyasejt ekvális osztódásával keletkeznek a neuronok (N). Attól függően, hogy melyik sejt osztódása során termelődik a FLP enzim, több féle klón létre jöhet. Ha a neuroblaszt osztódása során történik a rekombináció, akkor attól függően, hogy melyik utódsejt lesz homozigóta a mutációra, megkülönböztetünk többsejtes neuroblaszt klónt és kétsejtes klónt. A neuroblaszt klón esetében homozigóta mutáns neuroblaszt sejt jön létre, melynek továbbiakban minden utódsejtje mutáns lesz, míg a kétsejtes klón esetében a ganglion anyasejt és az abból származó két neuron lesz homozigóta mutáns. Egysejtes klón abban az esetben jön létre, ha a helyspecifikus rekombináció a ganglion anyasejt osztódása során történik meg, így csak az egyik neuron lesz homozigóta a mutációra nézve (3. ábra).

3.ábra MARCM klón-típusok 

Az, hogy mely sejtek fognak pozitívan jelölődni a Gal4 driver-től függ. Ha például egy gomba-test specifikus drivert használunk, akkor a klónokat a gombatest területén találjuk, ha azonban egy általános idegrendszeri drivert alkalmazunk, az egész idegrendszerben megfigyelhetjük a homozigóta mutáns klónokat. Ez természetesen azt jelenti, hogy a rekombináció az állat minden osztó szövetében végbe megy, pozitívan jelölve azonban csak a számunkra érdekes szövetekben/idegsejtekben lesz, így a szövet sejtjei könnyen vizsgálhatóak.

Irodalomjegyzék:

Lee, T; Luo, L (2001). Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences 24 (5): 251–4.